Reação em Cadeia da Polimerase – PCR

 

O advento da biologia molecular foi certamente um dos maiores passos das ciências biológicas durante o Século XX. A descoberta da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) trouxe enormes benefícios e desenvolvimentos científicos como o sequenciamento de genomas, a expressão de genes em sistemas recombinantes, o estudo de genética molecular, a determinação rápida da paternidade e o diagnóstico rápido de doenças infecciosas.

A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction), é uma metodologia que pode ser executada inteiramente “in vitro” sem o uso de células. A técnica da PCR foi desenvolvida nos anos 80 por Kary Mullis, que recebeu, em 1994, o prêmio Nobel.

A PCR possibilita a síntese de fragmentos de DNA, usando a enzima DNA-polimerase, a mesma que participa da replicação do material genético nas células. Esta enzima sintetiza uma sequência complementar de DNA, desde que um pequeno fragmento (o iniciador, ou primer, em inglês) já esteja ligado a uma das cadeias do DNA no ponto escolhido para o início da síntese. Os iniciadores definem a sequência a ser replicada e o resultado obtido é a amplificação de uma determinada sequência DNA com bilhões de cópias.

O desenvolvimento da técnica de amplificação de segmentos de DNA utilizando a PCR abriu enormes perspectivas para a análise de genes, diagnóstico de doenças genéticas e detecção de agentes infecciosos como citomegalovírus, vírus da hepatite B e C, herpes vírus simples, vírus da rubéola, vírus da imunodeficiência humana (HIV), Chlamydia trachomatis, Helicobater pylori, Mycobacterium tuberculosis e Pneumocistis carinii.

O avanço da ciência sobre a compreensão dos genes trouxe para a rotina do laboratório de genética, ferramentas que permitem o diagnóstico em nível molecular. Na linha das doenças genéticas, o permanente desenvolvimento de novos protocolos tem permitido a pesquisa de pequenas alterações na sequência de DNA, como, por exemplo, na fibrose cística.

Outras aplicações especialmente úteis para a PCR é a clonagem de um determinado fragmento de DNA, que pode ser um gene e o conhecimento do DNA codificante (cDNA) obtido a partir da molécula de RNA, o que permite o estudo da expressão de genes.

Finalmente, a PCR tem um grande potencial na medicina forense. Sua sensibilidade torna possível utilizar uma amostra bastante pequena (traços mínimos de sangue e tecidos que poderiam conter os restos de somente uma única célula) e ainda se obter uma “impressão digital de DNA” da pessoa da qual a amostra foi coletada, podendo assim fazer comparações com aqueles obtidos de vítimas e/ou suspeitos de casos de infração penal.

O genoma de cada ser humano (exceto dos gêmeos idênticos) é diferente nas regiões polimórficas, sendo possível amplificar essas regiões. Assim, a pesquisa de STRs (Small Tandem Repeats) através da PCR, utilizando um conjunto de iniciadores que cobrem estas partes altamente variáveis do genoma humano, pode gerar uma impressão digital característica de DNA para cada indivíduo.

DESNATURAÇÃO

A temperatura elevada ( geralmente >90ºC ) separa a cadeia dupla de DNA. As duas fitas de DNA são mantidas unidas por pontes de hidrogênio (relativamente fracas), que se rompem em altas temperaturas. As ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose (ligações covalentes e mais fortes) permanecem intactas.

HIBRIDIZAÇÃO OU ANNEALING

Temperatura de annealing ou hibridização: normalmente encontra-se entre 40°C e 65°C, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequência. Os iniciadores (os primers) marcam as extremidades da sequência alvo: estes iniciadores são curtas sequências sintéticas de nucleotídeos, entre 20 e 30 bases. Numa reação de PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de desnaturação.

EXTENSÃO

Após a ligação dos primers ou iniciadores às sequências complementares de DNA, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72ºC e a enzima taq polimerase replica a cadeia de DNA. O processo de síntese é iniciado onde estão ligados os primers, incorporando os nucleotídeos complementares à sequência alvo através dos dNTPs em solução. A extensão inicia-se sempre no extremo 3’ do primer. A taq polimerase sintetiza exclusivamente na direção 5’ para 3’.

REVELAÇÃO

Finalizada a PCR, o próximo passo é detectar a presença de produtos amplificados. Em geral, isso é realizado pela eletroforese em gel de agarose (corado com brometo de etídeo) ou poliacrilamida (corado pelo nitrato de prata).

Referência: NOVAIS, C.M; ALVES, M.P. PCR em tempo real. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento. Edição nº 33. 2004.